His-tag 정제 완충액 (용해·세척·용출) 만드는 법
Ni-NTA로 His-tag 단백질을 정제할 때 쓰는 세 가지 완충액입니다. 모두 50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, pH 8.0이고 imidazole 농도만 다릅니다: 용해 10 mM → 세척 20 mM → 용출 250 mM.
🧮 부피 계산기
| 성분 | 넣을 양 | 최종 농도 (1X) |
|---|---|---|
| NaH₂PO₄·H₂O | 3.45 g | 50 mM |
| NaCl | 8.77 g | 300 mM |
| Imidazole | 340 mg | 10 mM |
| NaH₂PO₄·H₂O | 3.45 g | 50 mM |
| NaCl | 8.77 g | 300 mM |
| Imidazole | 680 mg | 20 mM |
| NaH₂PO₄·H₂O | 3.45 g | 50 mM |
| NaCl | 8.77 g | 300 mM |
| Imidazole | 8.51 g | 250 mM |
| 물 (증류수) | 최종 부피까지 |
만드는 순서
- 모든 성분을 최종 부피의 약 80% 물에 녹입니다.
- NaOH로 pH 8.0을 맞춥니다 (imidazole이 pH를 바꾸므로 넣은 뒤에 맞춤).
- 물로 최종 부피를 맞춥니다.
- 필터로 거르고 4 °C에 보관합니다.
알아 둘 점
- 쓰는 순서: 용해 완충액으로 세포를 깨고 레진에 붙임 → 세척 완충액으로 레진 부피의 10–20배 씻음 → 용출 완충액으로 떼어 냄.
- 비특이 결합이 많으면 세척의 imidazole을 20–40 mM으로 올리고, 목표 단백질이 세척에서 빠져나오면 낮춥니다.
- EDTA·DTT는 니켈을 빼앗으므로 넣지 않습니다 (필요하면 β-ME 최대 20 mM).
자주 묻는 질문
imidazole의 A280 흡광이 문제가 되나요?
고농도 imidazole은 280 nm에서 흡광합니다. 같은 완충액을 blank로 쓰거나 BCA·Bradford로 정량하세요.
용출한 단백질의 imidazole은 어떻게 없애나요?
투석하거나 탈염 칼럼(desalting column)으로 완충액을 바꿉니다. 오래 두면 단백질이 뭉칠 수 있으니 용출 후 빨리 바꾸는 것이 좋습니다.
참고 문헌
- Hochuli E, Bannwarth W, Döbeli H, Gentz R, Stüber D. Genetic approach to facilitate purification of recombinant proteins with a novel metal chelate adsorbent. Bio/Technology. 1988;6:1321–1325.
- Green MR, Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2012.
- Harlow E, Lane D. Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1988.
널리 쓰이는 표준 조성입니다. 시약의 수화물 형태·순도에 따라 양이 달라질 수 있으니 병 라벨의 분자량(FW)을 확인하고, 소속 기관의 안전 규정과 제조사 설명서를 따르세요.