샌드위치 ELISA
바닥에 붙인 포획 항체(capture)와 검출 항체(detection) 사이에 표적 단백질을 끼워 잡고, 효소 발색으로 양을 재는 방법입니다. 표준곡선이 S자 모양이라 샘플이 곡선의 가운데에 오도록 희석하는 것이 핵심입니다.
핵심
- 샘플이 표준곡선 가운데에 오도록 희석 — 모르면 두세 가지 희석
- 세척이 배경과 반복 오차를 좌우합니다
- 곡선은 직선이 아니라 4PL로 맞춤
준비물
- capture·detection 항체 쌍 (또는 키트)
- 표준 단백질
- ELISA용 96-well 플레이트
- 세척 버퍼 (PBS + 0.05% Tween-20)
- Blocking 버퍼 (1% BSA/PBS 등)
- Streptavidin-HRP
- TMB 기질, 정지액 (산)
- 450 nm 플레이트 리더 (570 nm 보정 가능하면 좋음)
단계
- 💡 표준 연속 희석은 시약 계산기의 "연속 희석" 탭으로 계산할 수 있습니다.
🔬 변수 탐색 — 바꾸면 무엇이 달라질까?
뼈대는 같아도 농도·시간·시약은 실험마다 바꿔 씁니다. 항목을 누르면 무엇에 영향을 주는지, 두 조건(A·B)을 나란히 놓으면 어떻게 달라지는지 볼 수 있습니다.
샘플 희석
무엇을 바꾸나샘플을 몇 배로 묽힐지. S자 곡선의 가운데는 기울기가 커서 정확하고, 양 끝은 완만해 부정확합니다.
덜 희석하면덜 희석: 가장 진한 표준을 넘어 포화 — 농도를 알 수 없습니다.
더 희석하면너무 희석: 검출 한계 근처라 0처럼 보이거나 변동이 큽니다.
보통 쓰는 값곡선 가운데. 예상 농도를 모르면 ×2와 ×10을 함께.
세척 횟수 · 세기
무엇을 바꾸나붙지 않은 항체·효소를 씻어 내는 단계.
낮추면 · 줄이면부족: 배경이 높고 반복 웰끼리 값이 들쭉날쭉합니다.
높이면 · 늘리면너무 세게·웰이 마름: 붙어 있던 항원·항체까지 떨어지고 가장자리가 튑니다.
보통 쓰는 값단계마다 3~5회, 웰이 마르지 않게 바로 다음 시약.
반응 시간 · 온도
무엇을 바꾸나항원–항체가 결합하는 시간.
낮추면 · 줄이면짧게·차갑게: 신호가 약하고 감도가 떨어집니다.
높이면 · 늘리면길게·따뜻하게: 배경이 오르고 진한 표준이 포화됩니다.
보통 쓰는 값키트 설명서 그대로, 모든 플레이트 같은 조건.
TMB 발색 시간
무엇을 바꾸나효소가 기질을 파란색으로 바꾸는 시간. 정지액으로 멈춥니다.
낮추면 · 줄이면짧게: 낮은 농도의 표준끼리 구분이 안 됩니다.
높이면 · 늘리면길게: 가장 진한 표준이 포화(OD > 3)되어 곡선 위쪽이 평평해집니다.
보통 쓰는 값가장 진한 표준이 뚜렷한 파랑이 되고 OD가 약 2~2.5일 때 멈춤.
곡선 모델
무엇을 바꾸나흡광도를 농도로 바꾸는 식.
보통 쓰는 값4PL (또는 5PL).
문제 해결
| 문제 | 흔한 원인 | 해결 |
|---|---|---|
| 전체 배경이 높음 | 세척·blocking 부족, HRP 과다, 교차 오염 | 세척 횟수↑, 새 팁 사용, HRP 희석 확인 |
| 표준곡선이 평평함 | 표준 손상, 시약 순서 실수, 오래된 TMB | 새 표준, 순서 확인, TMB는 무색인지 확인 |
| 샘플이 모두 가장 진한 표준보다 높음 | 희석 부족 | 더 희석해 다시 측정 |
| 반복 CV가 15%를 넘음 | 피펫 오차, 기포, 세척 불균일 | 멀티채널 피펫, 기포 제거, 세척기 점검 |
⚠ 안전 정지액(산)은 부식성입니다 — 보안경과 장갑을 쓰세요.
이 페이지는 널리 쓰이는 일반 조건을 정리한 것입니다. 시약·키트·항체 설명서와 소속 기관의 안전 규정을 우선하세요. 시뮬레이터 중 "개념 그림"은 경향을 보여 주는 단순 모델입니다.
결과 정리는 무료 도구로:
표준곡선 계산기 (ELISA 4PL) → 연속 희석 계산 → 그룹 비교 통계 →