BCA·Bradford·ELISA 표준곡선 제대로 쓰기
표준곡선은 농도를 아는 표준물질의 흡광도로 "흡광도 → 농도" 환산표를 만드는 일입니다. 곡선 종류를 분석법에 맞게 고르고, 샘플이 표준 범위 안에 있는지 확인하는 것이 핵심입니다.
1. 분석법별 곡선 고르기
| 분석 | 추천 곡선 | 이유 |
|---|---|---|
| BCA | 2차 곡선 (범위가 좁으면 직선) | 고농도에서 조금 휨 |
| Bradford | 2차 곡선 | 휘는 정도가 더 큼 |
| ELISA | 4PL | 저농도는 완만, 고농도는 포화되는 S자 |
R²만 보지 말고, 곡선에서 거꾸로 계산한 표준물질 농도가 실제 값의 80–120% 안에 드는지(회수율)로 확인하세요. R²가 0.99여도 낮은 농도 쪽이 크게 틀릴 수 있습니다.
2. blank와 범위
- 농도 0 표준(blank)의 흡광도를 모든 값에서 뺍니다.
- 샘플 흡광도가 가장 높은 표준보다 크면 곡선 밖으로 나가 계산할 수 없습니다. 더 희석해서 다시 측정하세요.
- 가장 낮은 표준보다 작으면 정확도가 떨어집니다. 덜 희석하거나 더 민감한 방법을 씁니다.
- 반복 웰의 CV가 15%를 넘으면 피펫팅이나 거품을 확인하세요.
3. 희석 배수와 예시
곡선에서 읽은 농도에 희석 배수를 곱해야 원래 샘플의 농도입니다.
| 샘플 | 곡선에서 읽은 값 | 희석 | 원래 농도 |
|---|---|---|---|
| 세포 lysate | 436 µg/mL | ×5 | 2,180 µg/mL = 2.18 µg/µL |
4. 웨스턴블랏 loading 부피 계산
샘플 부피(µL) = 올릴 단백질(µg) ÷ 농도(µg/µL)
예: 20 µg을 올리고 lysate 농도가 2.18 µg/µL면 샘플 9.2 µL입니다. 최종 20 µL에 4x sample buffer를 쓰면 buffer 5 µL, 나머지 5.8 µL는 물로 채웁니다. 모든 lane을 같은 µg으로 맞추는 것이 loading control 정규화보다 먼저입니다. (웨스턴블랏 밴드 정량)
5. 자주 하는 실수
- 표준물질과 샘플의 버퍼가 다름: lysis buffer의 계면활성제·환원제가 BCA 발색을 바꿉니다. 표준물질도 같은 버퍼로 희석하세요.
- 곡선 밖으로 외삽: 가장 높은 표준보다 큰 값을 곡선을 연장해 읽으면 크게 틀립니다.
- 플레이트마다 곡선을 새로 그리지 않음: 표준곡선은 매 플레이트, 매 실험마다 새로 만듭니다.
표준물질과 샘플 흡광도를 붙여넣으면 알맞은 곡선을 골라 농도를 계산하고, 범위 밖 샘플을 표시하며 웨스턴블랏 loading 부피까지 알려 줍니다.
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