웨스턴블랏 밴드 정량(densitometry) 방법
밴드 정량은 "밴드가 진하다"를 숫자로 바꾸는 일입니다. 핵심은 네 단계입니다. 밴드 세기 측정 → 배경 빼기 → loading control로 나누기 → 기준 lane을 1로 맞추기.
1. 이미지 준비
- 촬영 장비가 저장한 원본 TIFF를 씁니다. JPEG나 화면 캡처는 압축·보정 때문에 값이 달라집니다.
- 밝기·대비를 조정한 이미지로 정량하지 않습니다. 보기 좋게 만드는 조정은 figure용 사본에만 적용합니다.
- 밴드가 포화되지 않은 노출 시간의 이미지를 고릅니다. (정량에서 흔한 실수)
2. 밴드 세기: integrated density
밴드를 감싸는 사각형(ROI) 안의 픽셀 신호를 모두 더한 값이 integrated density입니다. 흰 배경에 검은 밴드 이미지라면 신호 = 255 − 밝기(8-bit 기준)로 바꿔 더합니다.
Integrated density = Σ (픽셀 신호 − 배경)
같은 단백질의 lane들은 같은 크기의 박스로 재야 비교가 공정합니다.
3. 배경 차감 방식
| 방식 | 방법 | 장단점 |
|---|---|---|
| 박스 테두리(local) | 밴드 박스 가장자리 픽셀의 중앙값을 배경으로 | lane마다 배경이 달라도 맞춰짐. 대부분 권장 |
| 빈 영역 | 밴드 없는 곳에 따로 그린 박스의 평균 | 배경이 고르면 간단. 얼룩이 있으면 부정확 |
| rolling ball | 이미지 전체의 완만한 배경을 추정해 제거(ImageJ) | 번진 배경에 강함. 반경 설정에 따라 값이 변함 |
어떤 방식을 썼는지 Methods에 적어야 재현할 수 있습니다.
4. 정규화와 상대값: 예시
EGF 자극 후 p-ERK를 β-actin으로 정규화하는 교과서 예시입니다(값은 배경 차감 후 integrated density).
| Lane | p-ERK | β-actin | 비율 | 상대값 |
|---|---|---|---|---|
| 대조군 | 12,000 | 40,000 | 0.300 | 1.00 |
| EGF 5분 | 30,000 | 38,000 | 0.789 | 2.63 |
| EGF 15분 | 52,000 | 41,000 | 1.268 | 4.23 |
비율 = target ÷ loading control · 상대값 = 비율 ÷ 기준 lane의 비율
인산화 단백질은 loading control 대신 같은 단백질의 total 형태(예: p-ERK / total ERK)로 나누는 경우가 많습니다.
5. 반복 실험 통계
블랏마다 노출과 감도가 달라 원시 값은 블랏끼리 비교할 수 없습니다. 그래서 각 블랏에서 기준 lane = 1로 맞춘 상대값을 모아 평균 ± SD를 냅니다. n은 독립적으로 반복한 블랏(실험) 수입니다.
기준 lane은 항상 1이므로, "처리군이 1과 다른가"는 one-sample t-test로, 여러 그룹 비교는 ANOVA로 봅니다. 상대값은 비율이라 log로 바꿔 검정하는 방법도 널리 쓰입니다.
블랏 이미지를 올리면 lane과 밴드를 자동으로 찾아 정량하고, 반복 실험 통계와 논문용 figure·PPT까지 만듭니다.
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