웨스턴블랏 정량에서 흔한 실수 7가지
정량 결과가 이상할 때 원인은 대개 계산이 아니라 이미지와 실험 조건에 있습니다. 아래 일곱 가지만 피해도 신뢰도가 크게 올라갑니다.
1. 포화된 밴드를 정량한다
신호가 최댓값(8-bit에서 255)에 닿은 밴드는 실제 양이 늘어도 값이 더 커지지 않습니다. 강한 밴드가 과소평가되어 차이가 줄어듭니다. 노출 시간을 여러 단계로 찍고, 가장 진한 밴드도 포화되지 않은 이미지를 고르세요. 가능하면 16-bit로 저장합니다.
2. 밝기·대비를 조정한 이미지로 정량한다
레벨·감마 조정은 픽셀 값을 바꿉니다. 특히 감마(비선형) 조정은 약한 밴드와 강한 밴드를 다르게 바꿔 비율 자체를 왜곡합니다. 정량은 항상 원본으로 하세요.
3. loading control이 포화되거나 선형 범위를 벗어났다
β-actin, GAPDH 같은 loading control은 양이 많아 쉽게 포화됩니다. 포화되면 로딩 차이를 보정하지 못합니다. 로딩량이나 항체 농도를 낮추고, 최근 저널들이 권장하는 total protein 정규화(stain-free 젤, Ponceau S 염색)도 고려하세요.
4. lane마다 박스 크기가 다르다
박스가 크면 배경이 더 들어가고 작으면 밴드가 잘립니다. 같은 단백질의 모든 lane은 같은 폭·높이의 박스로 재세요.
5. 배경 차감을 하지 않거나 방식이 제각각이다
배경을 빼지 않으면 약한 밴드의 상대 차이가 줄어듭니다. 한 실험 안에서는 같은 배경 차감 방식을 일관되게 쓰고 Methods에 적으세요. (배경 차감 방식 비교)
6. 다른 블랏의 원시 값을 바로 비교한다
블랏마다 전달 효율, 항체, 노출이 다릅니다. 블랏 간 비교는 각 블랏의 기준 lane으로 정규화한 상대값으로만 합니다.
7. JPEG로 저장하거나 화면을 캡처한다
JPEG 압축은 밴드 가장자리 값을 바꾸고, 화면 캡처에는 표시용 보정이 들어갑니다. 분석용으로는 장비의 원본 파일이나 TIFF를 쓰세요.
정량할 때 포화된 밴드와 loading control 편차를 자동으로 경고하고, 표시용 밝기 조정은 정량값에 영향을 주지 않습니다.
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