qPCR 데이터 문제 해결 체크리스트

1. Ct가 35 이상이다

주형이 아주 적으면 증폭 시작이 확률적으로 흔들려(Poisson 잡음) 반복값 편차가 커집니다. Ct 35 이상은 "발현이 매우 낮거나 거의 없음"으로 해석하고, 정량값으로 쓸 때는 주의 표시를 합니다. cDNA 양을 늘리거나 희석을 줄이는 것이 근본 해결입니다.

2. NTC(주형 없는 대조군)가 증폭됐다

• melt curve를 확인: 샘플과 다른 낮은 온도의 피크면 primer dimer, 같은 온도면 오염 가능성이 큽니다.
• 샘플 Ct와 NTC Ct의 차이가 5 사이클 이상이면 영향은 보통 작습니다(오염 비율 약 3% 이하).
• 오염이 의심되면 시약·물·피펫을 새로 바꾸고 작업 공간을 분리합니다.

3. technical replicate 편차가 크다

같은 샘플의 반복값은 보통 0.2–0.3 Ct 이내로 모입니다. 0.5 Ct 이상 벌어지면 피펫팅, 기포, 증발을 의심합니다.

튀는 값 하나를 뺄 때는 미리 정한 규칙을 모든 샘플에 똑같이 적용해야 합니다. 예: "3개 이상 반복일 때 중앙값에서 0.5 Ct 넘게 벗어난 값 1개 제외". 결과를 보고 원하는 값만 고르는 것은 피해야 합니다.

4. melt curve에 피크가 여러 개다

SYBR Green은 모든 이중가닥 DNA에 결합하므로, 원하지 않는 산물도 신호가 됩니다. 피크가 여러 개면 비특이 증폭이나 primer dimer입니다. primer 재설계, annealing 온도 조정, 전기영동으로 산물 크기 확인이 필요합니다.

5. genomic DNA 오염이 의심된다

역전사 효소를 넣지 않은 no-RT 대조군에서 증폭이 보이면 gDNA 오염입니다. DNase 처리를 하거나, primer를 exon–exon 경계에 걸치게 설계하면 막을 수 있습니다.

체크리스트

• □ NTC와 no-RT 대조군을 함께 돌렸다
• □ melt curve가 단일 피크다
• □ technical replicate 편차가 0.5 Ct 이내다 (예외는 규칙대로 처리)
• □ 정량에 쓴 Ct가 35 미만이다
• □ reference gene이 그룹 간에 안정하다