qPCR ΔΔCt 계산 방법: 2^−ΔΔCt 상대 정량 단계별 정리

1. 준비할 데이터

• 샘플마다 목표 유전자(target)의 Ct와 reference gene의 Ct (예: GAPDH, ACTB)
• 같은 샘플을 여러 well에 잰 technical replicate는 먼저 평균해서 샘플당 Ct 하나로 만듭니다.
• 어느 그룹이 기준이 될 대조군(control, calibrator)인지 정합니다.

2. 계산 4단계

ΔCt는 "reference 대비 목표 유전자가 얼마나 늦게 증폭됐는가"입니다. ΔCt가 작을수록 발현이 많습니다. ΔΔCt가 음수면 대조군보다 발현이 늘어난 것입니다.

3. 숫자로 따라 해 보기

대식세포에 LPS를 처리해 염증 유전자 IL6가 얼마나 늘었는지 보는 교과서 예시입니다.

LPS 그룹의 ΔΔCt = 6.1 − 10.2 = −4.1이므로 fold change = 2^4.1 ≈ 17.1배입니다. reference(GAPDH) Ct가 거의 같으므로, 목표 유전자 Ct가 4.0 줄어든 것이 대부분 그대로 반영됐습니다.

4. 이 방법이 맞으려면 (가정)

• primer 효율이 약 100%(사이클마다 2배)여야 합니다. 보통 90–110%면 괜찮다고 봅니다. 효율이 크게 다르면 Pfaffl 방법을 씁니다.
• reference gene이 실험 조건에 따라 변하지 않아야 합니다. 처리에 따라 reference Ct가 크게 움직이면 결과가 왜곡됩니다. (reference gene 고르는 법)

5. 반복 실험이 있을 때

biological replicate(독립 샘플)가 여러 개면 샘플마다 ΔΔCt와 fold change를 계산합니다. 이때 기준은 "대조군 샘플들의 평균 ΔCt"입니다. 그래서 대조군 샘플 각각의 fold change도 정확히 1이 아니라 1 근처로 퍼지며, 이것이 대조군의 변동입니다.

여러 날 나눠 돌린 plate라면, plate마다 그 plate의 대조군으로 기준을 잡은 뒤 합치는 것이 plate 간 차이를 줄이는 방법입니다. 통계는 fold change가 아니라 ΔCt 또는 log₂ fold change에 적용하는 것이 원칙입니다. (반복 실험과 통계)

6. 자주 하는 실수

• fold change를 산술평균하기: fold change는 비대칭(0.5배와 2배는 같은 크기의 변화)이라, 평균은 log₂ 값으로 내고 되돌리는 것(기하평균)이 맞습니다.
• technical replicate를 n으로 세기: 같은 샘플을 세 번 잰 것은 n = 1입니다.
• Ct 35 이상 값을 그대로 쓰기: 증폭이 약해 편차가 큽니다. (qPCR 데이터 문제 해결)
• 대조군을 샘플 하나로만 잡기: 그 샘플의 우연한 편차가 모든 결과에 들어갑니다.