qPCR reference gene 고르는 법과 여러 개 쓰기

1. 좋은 reference gene의 조건

• 실험 조건(처리, 시간, 세포 종류)에 따라 발현이 변하지 않는다 — 가장 중요합니다.
• 목표 유전자와 비슷한 발현 수준이면 좋습니다. 18S rRNA처럼 너무 많으면(Ct 10 안팎) 차이를 보기 어렵습니다.
• primer 효율이 좋고 특이적입니다(melt curve 단일 피크).

자주 쓰는 후보: GAPDH, ACTB(β-actin), B2M, RPLP0, TBP, HPRT1, PPIA, YWHAZ, UBC 등.

2. 흔히 쓰는 유전자도 변할 수 있다

GAPDH는 해당과정 효소라 저산소, 대사 변화, 일부 약물 처리에서 발현이 바뀔 수 있습니다. ACTB는 세포골격 변화(분화, 이동, 형태 변화)에 영향을 받을 수 있습니다. "모두가 쓰니까"가 아니라 내 실험 조건에서 안정한지를 확인해야 합니다.

3. 안정성 확인하는 간단한 방법

• 원시 Ct 비교: 같은 양의 RNA를 썼을 때, 후보 reference의 Ct가 그룹 간에 거의 같아야 합니다. 경험적으로 그룹 평균 차이가 0.5 Ct 이내면 양호합니다.
• 전용 알고리즘: geNorm(M 값), NormFinder, BestKeeper 같은 도구가 여러 후보 중 가장 안정한 조합을 골라 줍니다.
• 새 모델이나 새 처리 조건이라면 후보 3–5개를 먼저 비교해 보는 것을 권합니다.

4. 여러 개를 쓰는 이유와 방법

MIQE 가이드라인은 검증된 reference gene 2개 이상을 권장합니다. 한 유전자의 우연한 변동이 결과를 좌우하지 않게 하기 위해서입니다.

합칠 때는 산술평균이 아니라 기하평균을 씁니다. Ct는 이미 로그 척도라, 실제로는 reference들의 Ct를 평균한 값으로 ΔCt를 계산하는 것과 같습니다(효율이 모두 같을 때).