ΔΔCt와 Pfaffl 방법 차이: primer 효율과 효율 보정
ΔΔCt는 모든 primer가 사이클마다 정확히 2배씩 증폭된다고 가정합니다. 실제 효율이 이와 다르면 Pfaffl 방법이 유전자마다 측정한 효율을 계산에 넣어 보정합니다.
1. primer 효율 측정: 표준곡선
cDNA를 10배씩 5단계 정도 희석해 Ct를 재고, x축 = log10(농도), y축 = Ct로 직선을 그립니다. 이 직선의 기울기(slope)로 효율을 구합니다.
E = 10(−1/slope) · 효율(%) = (E − 1) × 100
| 기울기 | E | 효율 | 판단 |
|---|---|---|---|
| −3.32 | 2.00 | 100% | 이상적 |
| −3.10 | 2.10 | 110% | 허용 상한 근처 |
| −3.58 | 1.90 | 90% | 허용 하한 근처 |
일반적으로 효율 90–110%, R² 0.98 이상이면 좋은 primer로 봅니다.
2. Pfaffl 공식
Ratio = EtargetΔCttarget(대조군 − 샘플) ÷ ErefΔCtref(대조군 − 샘플)
ΔΔCt 공식에서 "2"를 유전자마다 측정한 E로 바꾼 것입니다. 두 효율이 모두 2이면 결과는 2−ΔΔCt와 똑같습니다. reference gene이 여러 개면 분모에 각 reference 값의 기하평균을 씁니다.
3. 효율이 다르면 결과가 얼마나 달라질까
ΔΔCt 글의 예시(대조군 IL6 28.4 → LPS 24.4, GAPDH 18.2 → 18.3)에 IL6 효율 90%(E = 1.90), GAPDH 효율 100%(E = 2.00)를 넣어 봅니다.
- 목표 유전자: 1.90(28.4 − 24.4) = 1.904.0 ≈ 13.0
- reference: 2.00(18.2 − 18.3) = 2−0.1 ≈ 0.93
- Pfaffl ratio ≈ 13.0 ÷ 0.93 ≈ 14.0배 (ΔΔCt로는 17.1배)
효율 10% 차이만으로도 결과가 약 20% 달라졌습니다. Ct 차이가 클수록 효율 차이의 영향이 커집니다.
4. 언제 무엇을 쓸까
- 효율을 따로 측정하지 않았다면 → ΔΔCt. 가장 널리 쓰이고, 대부분의 상용 primer는 효율이 100% 근처로 검증돼 있습니다.
- 표준곡선으로 효율을 측정했고 유전자 간 차이가 크다면 → Pfaffl.
- 어느 쪽이든 논문 Methods에 방법과 (Pfaffl이면) 효율 값을 적습니다. MIQE 가이드라인도 효율 보고를 권장합니다.
효율(%)만 입력하면 Pfaffl 보정 결과를 바로 계산하고, ΔΔCt와 비교할 수 있습니다.
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