클로닝 방법 비교: 언제 무엇을 쓸까
클로닝은 결국 insert를 vector에 원하는 방향·원하는 자리로 이어 붙이는 일입니다. 방법마다 필요한 준비물과 남는 흔적 서열이 달라서, 가진 vector와 insert에 따라 고르면 됩니다.
1. 한눈에 비교
| 방법 | 원리 | 흔적 서열 | 여러 조각 | 장점 | 주의 |
|---|---|---|---|---|---|
| 제한효소 + ligation | 같은 효소로 자른 끝끼리 ligase로 연결 | 효소 자리 남음 | 어려움 | 시약이 싸고 익숙함 | insert 안에 같은 자리가 없어야 함 |
| Gibson · HiFi | 겹치는 끝(20–30 nt)을 효소 혼합물이 이어 붙임 | 없음 (원하는 대로) | 쉬움 (2–6조각) | 자리 제약 없음 | 짧은 조각(<200 bp)·반복 서열은 까다로움 |
| In-Fusion | 15 nt 겹침으로 연결 | 없음 | 가능 | 빠르고 간단 | 전용 키트 필요 |
| Golden Gate | Type IIS 효소(BsaI 등)가 자리 밖을 잘라 4 nt 이음새로 연결 | 4 nt 이음새만 | 매우 쉬움 (10조각 이상) | 한 튜브, 순서·방향 고정 | insert 안의 BsaI 자리 제거 필요 |
| TA · TOPO | PCR 산물의 A 꼬리를 T vector에 연결 | vector 서열 | 불가 | primer 설계 불필요, 매우 빠름 | 방향이 무작위 |
| Gateway | att 자리 사이 재조합으로 옮김 | att 자리(≈25 nt) | 제한적 | 여러 발현 vector로 쉽게 옮김 | entry clone 먼저 필요 |
2. 어떻게 고를까
- vector MCS에 insert에 없는 효소 두 개가 있다 → 제한효소 클로닝이 가장 싸고 무난합니다. 서로 다른 두 효소로 방향을 고정하세요.
- 원하는 자리에 딱 맞게, 흔적 없이 넣거나 조각이 2개 이상 → Gibson·HiFi.
- 여러 부품을 순서대로 반복 조립(promoter + 유전자 + tag 등) → Golden Gate.
- PCR 산물을 일단 빨리 보관·시퀀싱 → TA/TOPO.
- 같은 유전자를 여러 발현 시스템으로 옮길 계획 → Gateway.
3. 제한효소 클로닝 순서와 숫자
- insert를 제한효소 꼬리 primer로 PCR (여분 염기 4–6개 + 자리)
- vector와 insert를 같은 두 효소로 자르기 → vector는 dephosphorylation(선택)으로 자기끼리 붙는 것 줄이기
- 젤 정제로 자른 조각 분리
- ligation: vector 50 ng, insert는 vector : insert = 1 : 3 몰 비율 (insert ng = vector ng × insert bp ÷ vector bp × 3)
- 형질전환 → 항생제 plate → 콜로니 확인
몰 비율 계산은 시약 계산기, 효소 자리 확인과 primer는 클로닝 도우미로 할 수 있습니다.
4. 클론 확인 — 세 단계
| 방법 | 무엇을 알 수 있나 |
|---|---|
| Colony PCR | insert가 들어갔는지 (vector primer + insert primer를 쓰면 방향도) |
| 제한효소 확인(diagnostic digest) | 전체 크기와 방향 — 조각 크기가 예상과 같은지 |
| Sanger 시퀀싱 | 서열 한 글자까지 — 돌연변이·frame 확인 (최종 확인은 반드시) |
5. 흔한 실패 원인
- 콜로니가 없음: competent cell 효율, 항생제 잘못, ligation 실패 — 대조군(자르지 않은 vector 형질전환)을 함께 하세요.
- 빈 vector만 나옴: vector가 한쪽만 잘렸거나 자기끼리 붙음 → 두 효소 모두 잘 잘리는지, dephosphorylation, 젤 정제 확인.
- 효소가 PCR 산물 끝을 못 자름: 여분 염기 부족 → 4–6개 추가.
- 메틸화로 안 잘림: XbaI·ClaI 등은 dam/dcm 메틸화에 막힐 수 있음 → 제조사 표 확인, dam⁻ 균주 사용.
- Gibson 실패: 겹침 Tm이 너무 낮거나 조각 비율이 맞지 않음 → 겹침 20–30 nt, insert:vector 2:1.
클로닝 도우미에서 제한효소 지도와 가상 절단 젤을 보고, 제한효소 꼬리 primer나 Gibson 겹침 primer를 바로 만들 수 있습니다.
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