Primer-BLAST 사용법: 칸별로 따라 하기

1. PCR Template — 주형 넣기

• 유전자의 RefSeq 번호(예: NM_로 시작)를 넣는 것이 가장 좋습니다. 번호를 넣어야 exon 경계 정보를 쓸 수 있습니다.
• FASTA 서열을 붙여넣어도 되지만, 이 경우 exon 경계 기능은 제한됩니다.
• 특정 구간에만 primer를 원하면 "Range"의 From/To에 위치를 넣습니다.
• 가진 primer를 확인만 하려면 주형은 비워 두고 아래 Primer Parameters에 primer 두 개만 넣어도 됩니다.

2. Primer Parameters — 크기와 Tm

"Use my own forward/reverse primer" 칸에 primer를 넣으면 그 primer로 특이성만 확인하거나, 한쪽만 넣고 짝을 찾게 할 수 있습니다.

3. Exon/intron selection — qPCR의 핵심

• Exon junction span: "Primer must span an exon-exon junction"을 고르면 primer 하나가 두 exon의 이음새에 걸치도록 설계합니다. genomic DNA에서는 붙지 않으므로 DNase 처리가 불완전해도 안전합니다.
• Intron inclusion: "Primer pair must be separated by at least one intron"을 켜면 두 primer가 다른 exon에 놓입니다. genomic DNA에서는 산물이 훨씬 커져 구분됩니다.

둘 다 RefSeq 번호로 주형을 넣었을 때만 작동합니다. exon이 하나뿐인 유전자는 적용할 수 없으니 no-RT 대조군으로 대신 확인합니다.

4. Specificity checking — 어디와 비교할지

• Database: qPCR(cDNA)은 "Refseq mRNA", genomic PCR은 "Refseq representative genomes"나 "Genomes for selected organisms"가 알맞습니다.
• Organism: 반드시 실험하는 생물종을 넣습니다 (예: Homo sapiens, Mus musculus). 비워 두면 모든 생물과 비교해 느리고 결과가 복잡해집니다.
• 나머지 특이성 조건(불일치 허용 개수 등)은 기본값으로 두면 됩니다.

마지막으로 Get Primers를 누르면 1~몇 분 뒤 결과가 나옵니다.

5. 결과 읽는 법

• 각 primer 쌍마다 서열·Tm·GC·self complementarity와 함께 "Products on target templates"(원하는 유전자에서의 산물)가 나옵니다.
• "Products on potentially unintended templates"가 있으면 다른 유전자에서도 산물이 생길 수 있다는 뜻입니다. 크기가 비슷하고 불일치가 3′ 끝 근처에 없을수록 위험합니다.
• 같은 유전자의 여러 전사체(transcript variant)에만 산물이 생기는 것은 대개 괜찮습니다 — 오히려 모든 variant를 함께 재는 primer가 필요한 경우가 많습니다.
• Self complementarity와 Self 3′ complementarity 숫자는 작을수록 좋습니다.

6. 흔한 실수

• 생물종을 넣지 않아 결과가 끝없이 길어짐
• qPCR인데 산물 크기를 기본값(최대 1000 bp)으로 둠
• reverse primer를 주형 방향 그대로 입력 — 둘 다 5′→3′로 적어야 합니다
• Primer-BLAST 결과만 믿고 실험 검증을 생략 — 효율·melt curve·산물 크기(젤)는 직접 확인해야 합니다