웨스턴 블랏 SDS-PAGE → transfer → 검출
단백질을 크기로 나눈 뒤(SDS-PAGE) 막으로 옮기고(transfer) 항체로 특정 단백질만 찾아내는 방법입니다. 뼈대는 거의 같지만 젤 %, 로딩 양, 항체 희석, transfer 조건은 실험마다 바꿔 씁니다 — 아래 "변수 탐색"에서 바꾸면 무엇이 달라지는지 비교해 보세요.
핵심
- 단백질 크기에 맞는 젤 %를 고르는 것이 첫 단추입니다
- 표적과 loading control 모두 신호가 포화되지 않는 범위에서 찍어야 정량할 수 있습니다
- 항체 희석과 blocking은 항체마다 최적값이 다릅니다 — 처음엔 2~3가지를 나란히 비교
준비물
- 정량한 단백질 lysate (BCA 등)
- 4× Laemmli 샘플 버퍼 (환원제 포함)
- 아크릴아마이드 젤 (직접 붓거나 기성 젤)
- 전기영동 버퍼 (Tris-glycine-SDS)
- 전사 버퍼 (Tris-glycine + 메탄올)
- PVDF 또는 nitrocellulose 막, 필터지
- Blocking 용액 (5% 탈지분유 또는 BSA in TBST)
- 1차 항체, HRP 2차 항체
- TBST (Tris 완충 식염수 + 0.1% Tween-20)
- ECL 기질, 화학발광 이미저
단계
SDS-PAGE
- 💡 막 단백질은 끓이면 뭉칠 수 있어 37~70°C에서 10~30분 가열하기도 합니다.
- 💡 아래 "계산"의 젤 레시피와 "변수 탐색 → 젤 농도"를 참고하세요.
Transfer
항체 반응 · 검출
계산
SDS-PAGE 젤 레시피
🔬 변수 탐색 — 바꾸면 무엇이 달라질까?
뼈대는 같아도 농도·시간·시약은 실험마다 바꿔 씁니다. 항목을 누르면 무엇에 영향을 주는지, 두 조건(A·B)을 나란히 놓으면 어떻게 달라지는지 볼 수 있습니다.
젤 농도 (%)
무엇을 바꾸나아크릴아마이드 비율 = 젤 그물눈의 촘촘함. 촘촘할수록 작은 단백질을 잘 나눕니다.
낮추면 · 줄이면그물눈이 커서 큰 단백질이 잘 퍼지지만, 작은 단백질은 염료 선과 함께 아래로 빠져나갑니다.
높이면 · 늘리면작은 단백질이 잘 나뉘지만, 큰 단백질은 위쪽에 몰려 서로 구분되지 않습니다.
보통 쓰는 값보통 10~12%. 크기가 넓게 퍼진 단백질을 한 번에 보려면 4–20% gradient.
로딩 양 (µg)
무엇을 바꾸나레인에 올리는 총 단백질 양. 표적과 loading control의 신호 세기가 모두 달라집니다.
낮추면 · 줄이면양이 적은 표적은 보이지 않을 수 있습니다.
높이면 · 늘리면밴드가 번지고, 양이 많은 loading control이 먼저 포화되어 정규화 값이 틀어집니다.
보통 쓰는 값세포 lysate는 보통 10~40 µg. 처음엔 5·10·20·40 µg을 올려 선형 범위를 확인하세요.
Transfer 시간 · 메탄올 · 막
무엇을 바꾸나젤에서 막으로 단백질을 옮기는 조건. 단백질 크기에 따라 알맞은 조건이 다릅니다.
낮추면 · 줄이면짧게·메탄올 많이: 큰 단백질(>150 kDa)이 젤에 남습니다.
높이면 · 늘리면길게: 작은 단백질(<20 kDa)이 막을 뚫고 지나가 사라질 수 있습니다.
보통 쓰는 값wet 100 V 60~90분, 메탄올 20%. 큰 단백질은 메탄올 10% 이하·더 길게, 작은 단백질은 짧게·0.2 µm 막.
Blocking 용액
무엇을 바꾸나막의 빈자리를 단백질로 덮어 항체가 아무 데나 붙지 않게 합니다.
낮추면 · 줄이면짧게·묽게: 배경이 얼룩덜룩하게 높아집니다.
높이면 · 늘리면너무 길게·진하게: 표적 신호까지 가려 약해질 수 있습니다.
보통 쓰는 값실온 1시간, 5%. 항체 설명서가 권하는 blocking을 먼저 따르세요.
1차 항체 희석
무엇을 바꾸나항체를 얼마나 묽게 쓰느냐. 진할수록 신호도 배경도 함께 커집니다.
진하게 하면진하게(예: 1:250): 배경과 비특이 밴드가 늘고 항체가 낭비됩니다.
묽게 하면묽게(예: 1:20,000): 신호가 약해 보이지 않을 수 있습니다.
보통 쓰는 값설명서 권장 희석(보통 1:500~1:2,000)을 가운데 두고 2~3가지를 비교.
막 종류 (PVDF vs NC)
무엇을 바꾸나단백질을 붙잡는 막의 재질과 구멍 크기.
보통 쓰는 값일반적으로 PVDF 0.45 µm, 20 kDa보다 작은 단백질은 0.2 µm.
노출 시간 · ECL
무엇을 바꾸나화학발광 신호를 얼마나 오래 모으는가.
낮추면 · 줄이면짧게: 약한 밴드가 보이지 않습니다.
높이면 · 늘리면길게: 강한 밴드가 하얗게 포화되어 세기 차이를 잴 수 없습니다.
보통 쓰는 값여러 노출을 찍고 이미저의 포화 표시가 없는 것을 정량에 사용.
문제 해결
| 문제 | 흔한 원인 | 해결 |
|---|---|---|
| 밴드가 안 보임 | 단백질 부족, transfer 실패, 항체 문제 | Ponceau로 transfer 확인, 로딩 양↑, 항체 농도↑, 양성 대조군 |
| 배경이 전체적으로 높음 | blocking 부족, 항체 과다, 세척 부족, 막이 마름 | blocking 시간↑, 항체 더 묽게, 세척 횟수↑, 막을 마르지 않게 |
| 밴드가 여러 개 | 비특이 결합, 단백질 분해, 인산화·당화 같은 변형 | 항체 더 묽게, protease inhibitor 사용, 예상 크기·isoform 확인 |
| 밴드가 웃는 모양(smile)으로 휨 | 전압이 높아 열이 남, 샘플 염 농도 차이 | 전압 낮추기·차갑게, 샘플 버퍼 조성 맞추기 |
| 흰 점·빈 자리 | 젤과 막 사이 기포 | 샌드위치를 만들 때 롤러로 기포 제거 |
⚠ 안전 굳기 전 아크릴아마이드는 신경독성 물질입니다 — 장갑 필수. 메탄올은 휘발성·독성이 있으니 환기하세요. 전기영동 장치는 전원을 끈 뒤 뚜껑을 여세요.
이 페이지는 널리 쓰이는 일반 조건을 정리한 것입니다. 시약·키트·항체 설명서와 소속 기관의 안전 규정을 우선하세요. 시뮬레이터 중 "개념 그림"은 경향을 보여 주는 단순 모델입니다.
결과 정리는 무료 도구로:
웨스턴 블랏 밴드 정량 → BCA 표준곡선 · 로딩 부피 계산 → 시약·희석 계산기 →