SYBR Green qPCR
DNA가 두 배씩 불어날 때 SYBR 염료의 형광이 커지는 것을 매 cycle 재서, 형광이 기준선을 넘는 cycle(Ct)로 처음 양을 비교합니다. 주형 양은 2배 줄면 Ct가 약 1 늦어집니다.
핵심
- primer 효율 90~110%, melt curve 피크 하나
- 기술 반복 3개, NTC(주형 없음) 필수
- Ct 15~32 사이가 다루기 좋음
준비물
- 2× SYBR Green master mix
- Forward·Reverse primer (각 10 µM)
- cDNA
- Nuclease-free 물
- qPCR 플레이트·광학 필름
- qPCR 기계
단계
- 💡 첫 95°C 시간은 master mix의 효소 종류에 따라 다릅니다.
계산
SYBR master mix (20 µL 반응, cDNA 2 µL 별도)
🔬 변수 탐색 — 바꾸면 무엇이 달라질까?
뼈대는 같아도 농도·시간·시약은 실험마다 바꿔 씁니다. 항목을 누르면 무엇에 영향을 주는지, 두 조건(A·B)을 나란히 놓으면 어떻게 달라지는지 볼 수 있습니다.
cDNA 양 (희석)
무엇을 바꾸나웰에 넣는 주형의 양. 2배 줄면 Ct가 약 1 늦어집니다 (효율 100%일 때).
많이 희석하면많이 희석: Ct가 35를 넘어 반복 간 변동이 커집니다.
진하게 넣으면진하게: 역전사 시약·억제 물질이 함께 들어가 효율이 떨어집니다.
보통 쓰는 값Ct 15~32. 발현이 낮은 유전자는 덜 희석.
annealing 온도 · primer 설계
무엇을 바꾸나primer가 주형에 붙는 온도. primer의 Tm에 맞춰야 합니다.
낮추면 · 줄이면낮게: 엉뚱한 곳에도 붙어 비특이 산물·primer dimer가 생깁니다.
높이면 · 늘리면높게: primer가 잘 붙지 않아 산물이 줄고 Ct가 늦어집니다.
보통 쓰는 값SYBR qPCR은 보통 60°C. primer는 길이 18~25 nt, GC 40~60%, 두 primer Tm 차이 3°C 이내.
primer 농도
무엇을 바꾸나반응 속 primer 최종 농도.
낮추면 · 줄이면낮게(<100 nM): 신호가 약하고 Ct가 늦어집니다.
높이면 · 늘리면높게(>900 nM): primer끼리 붙어 melt curve 낮은 온도에 작은 피크(dimer)가 생깁니다.
보통 쓰는 값각 200~500 nM.
반복 수
무엇을 바꾸나기술 반복(같은 cDNA 여러 웰)은 피펫 오차를, 생물학적 반복(독립 샘플)은 실제 차이를 봅니다.
낮추면 · 줄이면적게: 튀는 값을 가려낼 수 없고 통계가 불가능합니다.
보통 쓰는 값기술 반복 3, 생물학적 반복 3 이상. 통계는 생물학적 반복으로.
reference 유전자
무엇을 바꾸나샘플 간 cDNA 양 차이를 보정하는 기준 유전자.
잘못 고르면처리에 따라 변하는 유전자를 쓰면 결과가 통째로 틀어집니다.
보통 쓰는 값실험 조건에서 Ct가 거의 변하지 않는지 확인하고, 가능하면 2개 이상.
문제 해결
| 문제 | 흔한 원인 | 해결 |
|---|---|---|
| NTC에서 증폭 | 오염 또는 primer dimer | melt curve로 구분, 새 시약, 작업 공간 분리 |
| melt curve 피크가 두 개 | 비특이 산물·dimer | annealing 온도↑, primer 농도↓, primer 재설계 |
| 반복 웰 Ct 차이 > 0.5 | 피펫 오차, 기포 | master mix 방식, 원심, 최소 부피 2 µL 이상 |
| 효율이 90% 미만 또는 110% 초과 | 억제 물질, 희석 오차, dimer | 표준곡선 다시, 희석을 정확히 |
⚠ 안전 SYBR 염료는 DNA에 결합하므로 장갑을 끼고 다루세요.
이 페이지는 널리 쓰이는 일반 조건을 정리한 것입니다. 시약·키트·항체 설명서와 소속 기관의 안전 규정을 우선하세요. 시뮬레이터 중 "개념 그림"은 경향을 보여 주는 단순 모델입니다.
결과 정리는 무료 도구로:
qPCR 분석 (ΔΔCt·Pfaffl) → primer 효율 표준곡선 → primer 녹이기 계산 →