RNA 추출 페놀·구아니딘 방식
세포를 페놀·구아니딘 시약으로 녹이고 클로로포름으로 층을 나누면 RNA는 위쪽 투명한 수용액 층에 남습니다. 이를 이소프로판올로 가라앉혀 모읍니다. RNase를 막는 것과 층을 섞지 않는 것이 전부입니다.
핵심
- RNase-free 도구·장갑, 샘플은 빨리 용해
- 상층(수용액)만 조심스럽게 — 중간층을 건드리면 DNA·단백질 오염
- 순도는 A260/280(≈2.0)과 A260/230(2.0~2.2)으로 확인
준비물
- 페놀·구아니딘 시약 (TRIzol 등)
- 클로로포름
- 이소프로판올
- 75% 에탄올 (RNase-free 물로 만든 것)
- RNase-free 물
- RNase-free 팁·튜브
- 4°C 원심분리기
- 분광광도계 (NanoDrop 등)
단계
- 💡 이 단계에서 −80°C에 보관했다가 나중에 이어서 할 수 있습니다.
🔬 변수 탐색 — 바꾸면 무엇이 달라질까?
뼈대는 같아도 농도·시간·시약은 실험마다 바꿔 씁니다. 항목을 누르면 무엇에 영향을 주는지, 두 조건(A·B)을 나란히 놓으면 어떻게 달라지는지 볼 수 있습니다.
시작 샘플 양
무엇을 바꾸나시약 1 mL에 넣는 세포·조직의 양.
줄이면적게: pellet이 눈에 안 보이고 잃어버리기 쉽습니다 → glycogen 같은 carrier를 넣으세요.
늘리면많이: 시약이 감당하지 못해 층이 잘 안 나뉘고 DNA·단백질 오염이 늘어납니다.
보통 쓰는 값10 cm²당 1 mL, 조직 50~100 mg당 1 mL.
상층 채취량
무엇을 바꾸나원심분리 후 위층을 얼마나 가져오는가.
적게 뜨면적게: 수율은 줄지만 순도는 안전합니다.
많이 뜨면끝까지: 중간층이 섞여 DNA·단백질·페놀 오염 → A260/280↓.
보통 쓰는 값상층의 70~80%. 욕심내지 않기.
순도 판독 (A260/280 · A260/230)
무엇을 바꾸나분광광도계의 두 비율로 오염을 짐작합니다.
보통 쓰는 값RNA: A260/280 ≈ 2.0, A260/230 2.0~2.2.
pellet 건조
무엇을 바꾸나에탄올을 날리는 시간.
짧게덜 말림: 남은 에탄올이 역전사·PCR을 방해합니다.
길게바짝 말림: RNA가 잘 녹지 않아 농도가 들쭉날쭉합니다.
보통 쓰는 값5~10분, pellet 가장자리가 투명해질 때.
추출 방법 비교
무엇을 바꾸나같은 RNA라도 추출 방식마다 장단점이 있습니다.
보통 쓰는 값일반 qPCR은 컬럼, 작은 RNA나 까다로운 조직은 페놀·구아니딘.
문제 해결
| 문제 | 흔한 원인 | 해결 |
|---|---|---|
| 수율이 낮음 | 샘플 부족, 불완전한 용해, pellet 유실 | 충분히 균질화, carrier 추가, 상층액 버릴 때 조심 |
| A260/280이 낮음 (<1.8) | 페놀·단백질 오염 | 상층을 적게 뜨기, 클로로포름 재추출 |
| A260/230이 낮음 (<1.5) | 구아니딘염·페놀 잔여 | 75% 에탄올 세척 한 번 더, 재침전 |
| RNA 분해 (전기영동에서 번짐) | RNase 오염, 샘플 방치 | 바로 용해, 얼음 위 작업, RNase-free 도구 |
| genomic DNA 오염 | 중간층 혼입 | DNase 처리, intron을 걸치는 primer 사용 |
⚠ 안전 페놀과 클로로포름은 독성이 있고 피부에 화상을 입힙니다 — 흄후드, 니트릴 장갑, 보안경을 쓰고 폐기물은 따로 모으세요.
이 페이지는 널리 쓰이는 일반 조건을 정리한 것입니다. 시약·키트·항체 설명서와 소속 기관의 안전 규정을 우선하세요. 시뮬레이터 중 "개념 그림"은 경향을 보여 주는 단순 모델입니다.
결과 정리는 무료 도구로:
A260 농도 · 순도 계산 → qPCR 분석 (ΔΔCt) →