cDNA 합성 역전사
역전사 효소로 RNA를 DNA(cDNA)로 바꾸는 단계입니다. qPCR의 모든 샘플이 같은 조건에서 전환되어야 비교가 공정해지므로, 샘플마다 같은 양의 RNA를 넣고 같은 master mix를 쓰는 것이 핵심입니다.
핵심
- 샘플마다 같은 RNA 양
- no-RT 대조군으로 genomic DNA 오염 확인
- 목적에 맞는 primer 종류 선택
준비물
- 정량한 RNA
- 역전사 키트 (버퍼·dNTP·RNase inhibitor·효소)
- primer (oligo-dT / 랜덤 헥사머)
- (선택) DNase
- RNase-free 물, PCR 튜브
- Thermal cycler
단계
- 💡 시약 계산기의 "희석" 탭으로 샘플별 부피를 빨리 계산할 수 있습니다.
- 💡 25°C 단계는 랜덤 primer가 붙게 하는 시간, 85°C는 효소를 멈추는 단계입니다.
계산
역전사 master mix (20 µL 반응, RNA 10 µL 별도)
🔬 변수 탐색 — 바꾸면 무엇이 달라질까?
뼈대는 같아도 농도·시간·시약은 실험마다 바꿔 씁니다. 항목을 누르면 무엇에 영향을 주는지, 두 조건(A·B)을 나란히 놓으면 어떻게 달라지는지 볼 수 있습니다.
RNA 넣는 양
무엇을 바꾸나한 반응에 넣는 총 RNA 양.
줄이면적게: Ct가 늦어져 발현이 낮은 유전자는 검출이 어렵습니다.
늘리면많이: 효소가 포화되고 억제 물질도 늘어 전환이 비례하지 않습니다.
보통 쓰는 값20 µL당 0.1~1 µg (키트 권장 범위), 모든 샘플 동일.
primer 종류
무엇을 바꾸나역전사가 어디서부터 시작할지 정합니다.
보통 쓰는 값일반 qPCR은 oligo-dT + 랜덤 혼합.
역전사 온도
무엇을 바꾸나효소가 RNA를 따라 DNA를 만드는 온도.
낮추면 · 줄이면낮게: GC가 많거나 접힌 부위에서 멈춰 짧은 cDNA가 생깁니다.
높이면 · 늘리면높게: 보통 효소는 불안정해져 수율이 떨어집니다 (열에 강한 효소는 50~55°C 가능).
보통 쓰는 값키트 권장 온도 (대개 42~50°C).
no-RT 대조군
무엇을 바꾸나효소만 빼고 똑같이 처리한 튜브. qPCR에서 신호가 나오면 genomic DNA가 섞인 것입니다.
보통 쓰는 값no-RT의 Ct가 샘플보다 5 cycle 이상 늦으면 영향이 작습니다 (약 1/32 이하).
문제 해결
| 문제 | 흔한 원인 | 해결 |
|---|---|---|
| Ct가 전반적으로 늦음 | RNA 양 부족·분해, 억제 물질 | 정량·무결성 다시 확인, A260/230 확인 |
| no-RT에서 신호 | genomic DNA 오염 | DNase 처리, intron을 걸치는 primer |
| 샘플마다 reference 유전자 Ct 차이가 큼 | RNA 투입량 불일치 | 정량 다시, 같은 양 투입, master mix 사용 |
⚠ 안전 특별한 유해 시약은 없지만 RNase 오염을 막기 위해 장갑을 자주 바꾸세요.
이 페이지는 널리 쓰이는 일반 조건을 정리한 것입니다. 시약·키트·항체 설명서와 소속 기관의 안전 규정을 우선하세요. 시뮬레이터 중 "개념 그림"은 경향을 보여 주는 단순 모델입니다.
결과 정리는 무료 도구로:
qPCR 분석 (ΔΔCt) → 희석 계산 →